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遗传算法优化超声复合酶辅助提取红枣多酚工艺及其组分分析

发布时间:2021-11-25 17:26所属平台:学报论文发表咨询网浏览:

摘要:通过单因素实验探究超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数对红枣多酚得率的影响。在此基础上,采用遗传算法优化超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺,并采用高效液相色谱分析酚类物质组成。结果表明,超声-复合酶辅助提取红枣多酚最优的工艺参数为:超声

  摘要:通过单因素实验探究超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数对红枣多酚得率的影响。在此基础上,采用遗传算法优化超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺,并采用高效液相色谱分析酚类物质组成。结果表明,超声-复合酶辅助提取红枣多酚最优的工艺参数为:超声功率200W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%。在此条件下,所得红枣多酚得率为(0.94±0.008)%。实验值和理论值的相对误差为3.29%。表明遗传算法优化红枣多酚提取工艺参数是可行的。经鉴定发现红枣中含有没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素8中酚类物质。研究结果为红枣多酚开发提供重要的参考依据。

  关键词:超声-复合酶辅助提取;红枣;多酚;工艺;组分

遗传算法

  红枣是鼠李科(Rhamnaceae)枣属植物枣树(ZiziphusjujubaMill.)的成熟果实,在我国有着悠久的种植历史。红枣中含有多酚、多糖、皂苷、色素、抗氧化酶和各种维生素等活性成分[1]。研究表明,红枣多酚具有较强的抗氧化活性,同时具有抗炎、抗肿瘤和保护心脑血管等功效[2]。

  红枣多酚提取是红枣作为功能性食品关键环节之一。目前多酚提取以溶剂提取为主,但该方式提取效率低、溶剂消耗量大、易造成环境污染[3],该方式已经不能满足当前红枣产业快速发展的需求。超声作为一种新型的物理提取技术,该方式利用超声所产生的“机械效应”和“空化效应”,破坏植物细胞壁,降低多酚由内向外的扩散阻力,提高扩散系数[4]。

  因此,该技术被广泛应用于花色苷[5]、黄酮[6]和多糖[7]等活性成分的提取。红枣细胞壁主要成分为纤维素、半纤维素和果胶。因此,利用纤维素酶和果胶酶等相关酶类可降解红枣细胞壁,同样也可以降低红枣多酚的扩散阻力,达到提高多酚得率的目的[8]。目前,采用超声-复合酶辅助提取红枣多酚的研究未见报道。除提取技术外,红枣多酚得率还取决于溶剂性质、萃取温度和超声功率等提取参数。

  因此,优化红枣多酚的提取条件是提高红枣多酚得率的关键。遗传算法(Geneticalgorithms,GA)可以进行反复迭代,使其无限趋于真值,预测和优化误差均较小。因此,该方法比较适用于多因素提取工艺优化。但采用该方法对红枣多酚的提取条件进行优化的研究鲜见报道。本研究采用超声-复合酶酶辅助提取技术对红枣多酚进行提取,探究超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数对红枣多酚得率的影响,并通过GA优化其提取工艺;采用高效液相色谱(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)酚类物质组成。

  1材料与方法

  1.1材料与试剂

  红枣:北京好想你红枣销售有限公司;果胶酶(2300U/g):河北冠朗生物科技有限公司;纤维素酶(2000U/g):上海联硕生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(2300U/g):宝鸡市国康生物科技有限公司;无水乙醇(分析纯)和甲醇(色谱纯):常州市启迪化工有限公司;碳酸钠和石油醚:河北言希化工有限公司;福林酚试剂:南通华汇化工有限公司;HP-20大孔吸附树脂:南京帕尔斯生物科技有限公司;没食子酸、咖啡酸、芦丁、原儿茶酸、绿原酸、肉桂酸、阿魏酸和槲皮素标准品(≥98%):上海澄绍生物科技有限公司。

  1.2仪器与设备

  YM-1000CT超声波提取仪:上海豫明仪器有限公司;FZG真空冷冻干燥机:常州市东南干燥设备有限公司;754N紫外可见分光光度计:南京晓晓仪器设备有限公司;KH19A高速离心机:湖南凯达科学仪器有限公司;Breezel1525高效液相色谱仪:美国Waters公司;RE-52AA型旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;DK-98-IIA型恒温水浴锅:天津市泰斯特仪器有限公司。

  1.3实验方法

  1.3.1样品前处理

  将新鲜的红枣用清水冲洗,自然晾干,用刀子剔除枣核,然后置于真空冷冻干燥机中干燥直到红枣含水率低于5%为止。采用植物粉碎机将其粉碎,过40目筛,即制得红枣粉末。将其密封避光保存在4℃冰箱中备用。

  1.3.2超声-复合酶辅助提取红枣多酚

  称取5.0g红枣粉末于具塞三角瓶中,按照料液比1∶30g/mL的比例加入不同体积分数的乙醇溶液,使其充分混合,加入不同质量比组成的复合酶(纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1,g/g/g),将其置于超声波提取仪中,设定超声时间30min,待提取结束后,将提取物离心(7000r/min,15min),过滤获得滤液,残渣重复3次上述操作,合并滤液,滤液在40℃旋转蒸发仪减压浓缩,真空冷冻干燥,制得红枣多酚提取物(Jujubetpolyphenolextract,JPE)。

  1.3.3红枣多酚得率测定

  没食子酸标准曲线的绘制:准确称量0.25g没食子酸标准品,采用蒸馏水将其溶解,并定容在50mL容量瓶中,从中取出1mL将其定容100mL,得到50μg/mL标准液。分别从中取出0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL,加入2mL福林酚试剂,混合均匀,然后加入2.5mL质量分数Na2CO3溶液,反应30s,用蒸馏水作对照,在765nm测定吸光度,以样品浓度作为横坐标(C),吸光度纵坐标(A),对数据进行回归分析,得到标准方式为:A=0.1326C+0.00783,相关系数R2=0.9993。

  1.3.4单因素实验

  选择超声-复合酶辅助提取法作为红枣多酚的提取方法,操作同1.3.2。以5g红枣粉末为提取对象,对超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数4个因素进行单因素实验,讨论上述4个因素对红枣多酚得率的影响。超声功率为100、150、200*、250和300W5个水平;复合酶添加量为0.10%、0.15%、0.20%*、0.25%和0.30%5个水平;提取温度为30、40、50*、60和70℃5个水平;乙醇体积分数为40%、50%、60%*、70%和80%5个水平。每组实验重复3次,结果用平均值±标准差表示。(注:*标记的因素保持恒定水平。)

  1.3.5响应面法(Responsesurfacemethod,RSM)实验

  组合实验是在单因素实验的基础上进行,本研究选取自变量分别为超声功率(X1)、提取温度(X2)、乙醇体积分数(X3)和果胶酶剂量(X4),响应值为多酚得率(Y)。根据Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken设计组合实验。

  1.3.6遗传算法设计

  GA是一种随机非线性优化算法,具有无限迭代的特点,使其预测和优化值无限趋于真值。利用RSM模型作为GA的适应度函数,对红枣多酚的提取工艺进行优化。优化过程中选择随机均匀函数和分散交叉函数,采用MatlabR2018b对超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺进行优化。

  1.3.7红枣多酚纯化

  采用40%乙醇溶液溶解在最优提取工艺下获得的JPE,然后将其定容至500mL容量瓶中作为样品溶液备用。从中取出400mL加入到预处理的HP-20大孔树脂柱中,用缓冲液将样品pH调至5~6,待吸附平衡后。采用体积分数70%乙醇溶液进行洗脱,洗脱流速为2.0mL/min,收集洗脱液,洗脱液先置于40℃旋转蒸发仪减压浓缩,然后将浓缩液置于真空冷冻干燥机中冻干,制得红枣多酚纯化物。

  1.3.8红枣多酚组分分析

  标准曲线绘制:分别准确称取1mg没食子酸、咖啡酸、芦丁、原儿茶酸、绿原酸、肉桂酸、阿魏酸和槲皮素标准品,用甲醇将其溶解,分别配制不同质量浓度的标准溶液。

  上述溶液分别过0.45μm滤膜,用于HPLC分析,利用峰面积作为纵坐标,标注品浓度作为横坐标,将两者进行线性回归,绘制每个标准品的标准方程。样品前处理:准确称取1mgJPE,用甲醇溶解,过0.45μm滤膜,用于HPLC分析。色谱条件:柱温和流速分别为20℃和0.8mL/min;进样量和检测波长分别为20μL和280nm;流动相A和B分别为体积分数5%甲醇溶液(含体积分数0.1%三氟乙酸)和色谱甲醇。洗脱条件:0~5min,0%B;5~15min,30%B;15~25min,30%B;25~40min,65%B;40~60min,100%B。

  2结果与分析

  2.1单因素对红枣多酚得率的影响

  当超声功率在100~250W范围内,随超声功率增加红枣多酚得率呈显著增加趋势(P<0.05)。其原因是随超声功率增加,超声所产生的“空化效应”和“机械效应”加速红枣细胞壁破裂,降低多酚由内向外的传质阻力,同时扩散系数增加,有利于多酚从细胞内扩散到提取溶剂中,增加多酚得率[10]。该方式提取所得的多酚得率明显高于李霄等[11]采用超声波提取陕北红枣多酚的得率。当超声功率超过250W,多酚得率随超声功率增加呈显著降低的趋势(P<0.05)。其原因是大的超声功率可能会破坏多酚结构,同时增加杂质溶解度,造成多酚得率降低[12]。

  综合考虑,本实验选择超声功率为200、250和300W三个水平进行后续组合实验。当复合酶添加量在0.10%~0.20%范围内,随复合酶添加量增加多酚得率呈现显著增加的趋势(P<0.05)。当复合酶添加量在0.20%时,多酚得率取得最大值(0.75±0.007)%。其原因是随复合酶添加量增加,复合酶催化红枣细胞壁发生降解,降低多酚由内向外的传递阻力,有利于多酚的提取[13]。

  在超声辅助作用下,采用复合酶提取红枣多酚得率高于Woo等[14]采用单一酶提取红枣多酚的得率。此外,对比张瑞妮[9]采用超声提取所得的红枣多酚得率发现,利用超声-复合酶辅助提取红枣多酚得率明显高于超声提取。但当复合酶添加量超过0.20%时,多酚得率随复合酶添加量呈显著降低的趋势(P<0.05)。其原因是复合酶添加量增加也有利于杂质的溶解,从而降低多酚的溶解度,不利于多酚的提取[15]。综合考虑,复合酶添加量选择0.15%、0.20%和0.25%三个水平进行后续的组合实验。

  2.2.2红枣多酚提取工艺参数优化

  采用MatlabR2018b对提取工艺进行优化,当运算迭代90次,红枣多酚得率取得最大值,此时实验因素(超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体 积分数)编码分别为-0.999、-1、1、-1,对应的因素水平分别为21.01%、22.36%、405.7W和1∶21.875g/mL,此时,所得红枣多酚得率的理论值为0.91%。

  2.2.3实验验证

  采用遗传算法优化超声-复合酶提取红枣多酚得率工艺参数为:超声功率200.05W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%,所得红枣多酚得率的理论值为0.91%。为验证遗传算法的可靠性,对工艺参数修正为:超声功率200W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%。按照上述因素水平进行三次重复实验,所得红枣多酚得率为(0.94±0.008)%,实验值和理论值的相对误差为3.29%。说明遗传算法可较好地模拟和预测红枣多酚得率。

  2.3红枣多酚组分分析

  2.3.1标准曲线及其回归方程8种标准曲线回归方程和HPLC分析。8种标准 品的回归方程相关性系数(R2)均在0.99以上。结果表明,采用峰面积定量分析红枣多酚组成是可行的。

  2.3.2红枣多酚主要成分分析

  红枣多酚初步纯化液的HPLC。通过对比标准品HPLC可知确定红枣多酚纯化物中含有8种多酚类物质,分别为没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素。通过标准品所对应的方程对红枣多酚纯化物中的酚类成分进行定量,可得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素含量分别为0.725、0.462、0.125、0.351、0.302、0.268、0.570和0.283mg/g。通过数据分析发现红枣多酚主要酚类物质为没食子酸和肉桂酸。

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  3结论

  本研究通过遗传算法优化超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺,得到最优工艺参数为:超声功率200W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%。在此条件下,所得红枣多酚得率为(0.94±0.008)%。在最优工艺下获得的红枣多酚纯化物含有8种多酚类物质,其中没食子酸和肉桂酸为主要的酚类物质。

  参考文献:

  [1]吴添文.响应面分析优化临界CO2萃取红枣多酚及其在卷烟中的应用[J].食品工业,2015,36(8):131-136.

  [2]雷昌贵,陈锦屏,卢大新.红枣的营养成分及其保健功能[J].现代生物医学进展,2006,6(3):56-57,62.

  [3]ChengD,ZhuCQ,CaoJK,etal.Theprotectiveeffects ofpolyphenolsfromjujubepeel(ZiziphusJujubeMill)onisoproterenol-inducedmyocardialischemiaandaluminuminducedoxidativedamageinrats[J].FoodandChemicalToxicology,2012,50(5):1302-1308.

  [4]TengH,LeeWY,ChoiYH.Optimizationofultrasonicassistedextractionofpolyphenols,anthocyanins,andantioxidantsfromraspberry(Rubuscoreanusmiq.)usingresponsesurfacemethodology[J].FoodAnalyticalMethods,2014,7(7):1536-1545.

  [5]ChenF,SunYZ,ZhaoGH,etal.Optimizationofultrasound-assistedextractionofanthocyaninsinredraspberriesandidentificationofanthocyaninsinextractusinghighperformanceliquidchromatography-massspectrometry[J].UltrasonicsSonochemistry,2007,14(6):767-778.

  [6]UpadhyayR,NachiappanG,MishraHN.UltrasoundassistedextractionofflavonoidsandphenoliccompoundsfromOcimumtenuiflorumleaves[J].FoodScienceandBiotechnology,2015,24(6):1951-1958.

  作者:徐迎涛,吴君

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